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生化实验讲义--电泳技术

更新:2016-05-17 10:10:06 | 作者: 来源: 阅读:
电泳技术发展简史
  1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。
  1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
  1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
  1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。
  从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。
  1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。 
  由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。
4.2 电泳的基本原理
  电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
  电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 
  电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm ? 14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),L是电极间距离。
  在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积。
  这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:
                 F’=6πrηυ
  式中r是球状分子的半径,η是缓冲液粘度,υ是电泳速度(υ= d / t,单位时间粒子运动的距离,cm / s )。当带电分子匀速移动时: F = F’,
               ∴  q?E = 6πrηυ
  由此可以看出,迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。 
  用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时,实际使用的是相对迁移率mR。
  带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离,如等电聚焦电泳;而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离,如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色,或者如果样品有放射性标记,则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
4.3 影晌电泳分离的主要因素
  由电泳迁移率的公式可以看出,影响电泳分离的因素很多,下面简单讨论一些主要的影响因素:
  1. 待分离生物大分子的性质
  待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说,分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。
  2. 缓冲液的性质
  缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度,从而对其带电性质产生影响,溶液pH值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液pH还会影响到其电泳方向,当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负电荷,其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性,缓冲液通常要保持一定的离子强度,一般在0.02-0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),由于离子氛与待分离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 
3. 电场强度
  电场强度(V/cm)是每厘米的电位降,也称电位梯度。电场强度越大,电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大,而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功(W)为:
              W=I2.R.t
  上式中:I为电流强度,R为电阻,t为电泳时间。
  电流所作的功绝大部分都转换为热,因而引起介质温度升高,这会造成很多影响:
  ①样品和缓冲离子扩散速度增加,引起样品分离带的加宽;②产生对流,引起待分离物的混合;③如果样品对热敏感,会引起蛋白变性;④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度,可以减小生热,但会延长电泳时间,引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
 4. 电渗
  液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子,在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;如果相反,则降低电泳速度。
  5. 支持介质的筛孔
  支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
4.4 电泳的分类
⑴ 区带电泳:电泳过程中,待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带,这是当前应用最为广泛的电泳技术。
⑵ 自由界面电泳: 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,是在U形管中进行电泳,无支持介质,因而分离效果差,现已被其他电泳技术所取代。  
⑶ 等速电泳:需使用专用电泳仪,当电泳达到平衡后,各电泳区带相随,分成清晰的界面,并以等速向前运动。
⑷ 等电聚焦电泳:由两性电解质在电场中自动形成pH梯度,当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。
  按支持介质的不同可分为:
⑴ 纸电泳(Paper electrophorisis)
⑵ 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)
⑶ 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)
⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)
⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
  按支持介质形状不同可它为:
⑴ 薄层电泳 ;   ⑵ 板电泳 ;   ⑶ 柱电泳。
  按用途不同可分为:
⑴ 分析电泳;  ⑵ 制备电泳;  ⑶ 定量免疫电泳; ⑷ 连续制备电泳。
  按所用电压不同可分为:
⑴ 低压电泳:100V~500V,电泳时间较长,适于分离蛋白质等生物大分子。
⑵ 高压电泳:1000V~5000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。
4.5 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳
  纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差,但由于其操作简单,所以仍有很多应用,特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
  纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2~3.5的酸性缓冲液,分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀,常用国产新华滤纸和进口的Whatman 1号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5cm~10cm处。样品可点成园形或长条形,长条形的分离效果较好。点样量为5?g~100?g和5?l~10?l。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿,样品液要求较浓,不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿,点样时可用吹风机吹干后多次点样,因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极,电压通常使用2~10 V/cm的低压电泳,电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质,则要使用50~200 V/cm的高压电泳,电泳时间可以大大缩短,但必须解决电泳时的冷却问题,并要注意安全。
电泳完毕记下滤纸的有效使用长度,然后烘干,用显色剂显色,显色剂和显色方法,可查阅有关书藉。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下,用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。
  醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似,只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜,其厚度为0.1~0.15mm。
  醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点:① 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后蛋白质区带更清晰。② 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小,吸水少,电渗作用小,电泳时大部分电流由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,完成全部电泳操作只需90 min左右。③ 灵敏度高,样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2?l 血清,点样量甚至少到0. 1?l,仅含5?g的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④ 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品,如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤ 醋酸纤维薄膜电泳染色后,用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板,有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
 
由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉,目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。 
4.6 琼脂糖凝胶电泳
  琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构,这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷,但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代,使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级,主要以硫酸根的含量为指标,硫酸根的含量越少,提纯等级越高。
  琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的阻碍作用较小,这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术,如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析,由于DNA、RNA分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用,这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。另外,一些低熔点的琼脂糖(62 ~ 65 ?C)可以在65 ?C时熔化,因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
 
  由于琼脂糖凝胶的弹性较差,难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳,管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
4.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
  聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。
  聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在3%-30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如10%-20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。
  选择T和C的经验公式是:
            C = 6.5-0.3T
   此式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 ?1%,当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C是2.6%和3%。 
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月,在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂,操作时要避免直接接触皮肤,但它们聚合后则无毒。
  未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性,对于生物大分子的鉴定有重要意义,其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
  由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2 ,没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生“电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。⑥无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。 
  聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
  水平平板电泳近年来也有很快的发展,与垂直平板电泳相比也有其独特的优点:①由于凝胶可以直接铺在冷却板上,容易使凝胶冷却,因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快,通常只要1小时左右,而园盘电泳和垂直平板电泳一般需要3~4小时。③因为可以使用薄胶,加样少,染色快,从而提高了灵敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式,用途广泛,尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术,即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液,大大节约了试剂,简化了操作,提高了电泳速度。 
  聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C,T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。
4.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
  SDS-PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和?-巯基乙醇的样品处理液,SDS即十二烷基磺酸钠(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构,强还原剂?-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后,要在沸水浴中煮3~5 min,使SDS与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
  制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,例如通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104~105,即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶,而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径,这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质,需要使用低浓度如10%或7.5%的凝胶(孔径较大);而对于分离较小的蛋白质,使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后,通常在上面加上一层浓缩胶(约1 cm),并在浓缩上插入样品梳,形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶,由于浓缩胶具有较大的孔径(丙烯酰胺浓度通常为3~5%),各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低(通常pH = 6.8),用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳,上样后即可通电开始电泳。 
  聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统,即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统,不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统,其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4%,pH = 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5%,pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3,用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
  样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子,Cl-、甘氨酸阴离子以及蛋白质-SDS复合物,在浓缩胶的pH值下,甘氨酸只有少量的电离,所以其电泳迁移率最小,而Cl-的电泳迁移率最大。在电场的作用下,Cl-最初的迁移速度最快,这样在Cl-后面形成低离子浓度区域,即低电导区,而低电导区会产生较高的电场强度,因此Cl-后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后,Cl-和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质-SDS复合物由于相对量较少,聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被浓缩成很窄的区带(可以被浓缩三百倍),所以在浓缩胶中Cl-是快离子(前导离子),甘氨酸是慢离子(尾随离子)。
  当甘氨酸到达分离胶后,由于分离胶的pH值(通常pH = 8.8)较大,甘氨酸离解度加大,电泳迁移速度变大超过蛋白质-SDS复合物,甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质-SDS复合物。这时蛋白质-SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳,向正极移动。由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时,停止电泳,从平板中取出凝胶。在适当的染色液中(如通常使用的考马斯亮蓝)染色几个小时,而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料,这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1~1.5小时,电泳在25~30mA下通常需要3小时,染色2~3小时,过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。 
  Ornstein和Davis设计的高pH碱性不连续系统,有其独特的特点:① 浓缩胶的pH(6.8)小于慢离子甘氨酸的pKa(9.8)3个pH左右,所以 α≈ 0.001,即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1%离解,因此在电场中迁移很慢,是慢离子。② 快离子Cl-由于几乎全部离解,电泳迁移率最大,不受pH变化的影响。③ 分离胶的pH(8.8)小于慢离子的pKa 一个pH左右,α≈ 0.1,所以在分离胶中甘氨酸离解加大,电泳迁移率加大,就赶到蛋白质带的前面。
  此外还可以总结出该系统的特点有:④ 电极缓冲液中共轭碱Tris的pKa小于分离胶的pH约1个pH,使其缓冲能力大。⑤电极缓冲液的pH为8.3,相近于Tris的pKa(8.1),以便获得最大的缓冲能力。
  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定,在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳,测定各个的标准蛋白的电泳距离(或迁移率),并对各自分子量的对数(log Mr)作图,即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离(或迁移率),通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

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