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基于“实验设计”的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的建立(2)

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3 示例

3.1 GGT参考方法测量程序

3.2 GGT催化活性参考方法测量主要影响因素
       临床酶学参考方法测量影响因素在行业已基本达成共识(见图1)。根据QUAM理论,将这些因素与实验室制定的GGT参考方法测量程序综合分析,认定GGT催化活性参考方法测量的主要不确定度来源为波长、温度、吸光度、pH、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、反应液的挥发、试剂衰变、线性、测量结果变异共12个主要变异因素。
3.3 各因素对临床酶学参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.1 波长对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.1.1 评定方法
       为客观评价波长对GGT参考方法测量不确定度的影响量,设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高3个浓度水平的血清样本为实验对象,分别观察波长为408.5nm、410nm、411.5nm时3个浓度水平的血清酶活性变化,采用曲线拟合的方法计算波长与GGT催化活性的函数关系,据此计算波长对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上,根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
3.3.1.2 评定实验
       A 实验名称:波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响。
       B 实验目的:评定波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。
       C 实验方法:
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高三个浓度的混合血清。
b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量波长设定为变量,其它参数等同IFCC参考方法。分别在408.5nm、410nm、411.5nm进行三个血清样本GGT催化活性浓度的测量。
c) 将各血清测量结果录入表1,统计结果录入表2。
d) 建立波长与GGT催化活性浓度变化的函数关系,绘制波长与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图(图4)。
e) 计算波长变化对GGT测量影响的灵敏系数。
f) 根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
D 实验结果:
a)各浓度血清测量结果见表1。

b)各浓度血清数据处理结果见表2。

c)GGT催化活性浓度与波长的关系:见图4。

d) 波长对GGT测量影响灵敏系数的计算:
       根据波长对GGT催化活性浓度影响的函数关系:Y=-0.02X2+14.92X-2282.56,知波长每变化1nm,相应GGT催化活性浓度变化3.32%(灵敏系数)。
e)波长变化对GGT催化活性浓度测量不确定度影响量的评定根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求,GGT测量波长变化不能超过1nm,但是由于GGT测量受波长影响明显,因此实验室标准操作规程规定波长漂移不能大于0.2nm。假定波长变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布,该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为乘以波长变化对GGT测量影响的灵敏系数,即下式:
波长(输入量)引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度

E 实验结论
       波长变化(输入量)引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.33%。
3.3.1.3 评定结果
       波长对GGT催化活性参考测量影响的相对标准不确定度为0.33%。
3.3.2 温度对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.2.1 评定方法
       为客观评价温度对GGT参考方法测量不确定度的影响量,设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高4个浓度水平的血清样本为实验对象,分别观察比色杯内温度为36℃、37℃、38℃时4个浓度水平的血清酶活性变化,采用曲线拟合的方法计算温度与GGT催化活性的函数关系,据此计算温度对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上,根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
3.3.2.2 评定实验
       A 实验名称:温度变化对GGT测量不确定度的影响。
       B 实验目的:评定温度变化对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。
       C 实验方法:
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高四个浓度的混合血清。
b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量温度设定为变量,其它参数等同IFCC参考方法。分别在36℃、37℃、38℃进行四个血清样本GGT催化活性浓度的测量。
c) 将各血清测量结果录入表3,统计结果录入表4。
d) 建立温度与GGT催化活性浓度变化的函数关系,绘制温度与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图(图5)。
e) 计算温度变化对GGT测量影响的灵敏系数。
f) 根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
D 实验结果:
a)各浓度血清测量结果见表3。

b) 各浓度血清数据处理结果见表4。

c) GGT催化活性浓度与温度的关系见图5。

d) 温度对GGT测量影响灵敏系数的计算
       根据温度变化对GGT 催化活性浓度影响的函数关系:Y=3.200X-18.533,知温度每变化1℃,相应GGT催化活性浓度变化3.20%(灵敏系数)。
e)温度变化对GGT测量不确定度影响量的评定
       根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求,GGT测量温度变化不超过0.1℃。假定温度变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布,该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为乘以温度变化对GGT测量影响的灵敏系数,即下式:
温度(输入量)引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度

E 实验结论
       温度变化(输入量)引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%。
3.3.2.4 评定结果
       温度变化(输入量)引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%。
3.3.3 其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
       pH、吸光度等其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定可参照波长和温度因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定方法进行。
3.4 主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量不确定度影响量
       将基于“实验设计”方法获得的各主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量的灵敏系数按GUM理论进行不确定度分量的评定,结果列于表5。

注:表中C为correction factor(经灵敏系数纠正后的校正因子)

3.5 标准不确定度的合成
3.5.1 合成与计算方法
       合成标准不确定度是个估计的标准差,是合理赋予被测量Y之值的表征其分散性的参数,根据不确定度传播律(鉴于酶学测量的特殊性, 此处不确定度传播律可简化为估计值的合成方差为,指输入量彼此独立或不相关的线性函数,不包括非线性函数的高阶项),将每一影响因素按独立因素进行合成,相对合成标准不确定度计算公式如下:

合成标准不确定度计算公式如下:

3.5.2 合成标准不确定度计算:
       以GGT为例,实验室测量GGT催化活性浓度的不确定度来源有12个:波长、吸光度、pH、温度、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、蒸发、试剂衰变、测量线性和实验室测量结果变异,以上12个输入量引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度分别为0.33%、0.17%、0.13%、0.18%、0.31%、0.87%、0.22%、0.02%、0.06%、0.29%、0.10%、0.50%,相对合成标准不确定度计算如下:

GGT的测量均值为124.5U/L,其合成标准不确定度为:

3.6 扩展不确定度计算
3.6.1 计算方法的选择:
       扩展不确定度计算方法有二种:U=k X uc (y)Up=kp X uc (y)中U/Up为扩展不确定度,k/k为包含因子,uc (y)为合成标准不确定度。
       假定Y值的分布为正态分布,当Veff(合成标准不确定度的自由度,即有效自由度,公式为时,应使用U=k X uc (y)计算方法,包含因子K选择2o对U 的估计,其置信概率近似为95%,此种计算方法可包含测量结果预估值的大部分。
       Veff 小于6时,应选择Up=kX uc (y)的计算方法,即依据置信概率p(双侧)的t 分布临界值和公式kp=tp X (Veff),求出相应的包含因子k值,一般采用的p值为99%或95%,多数情况下选择95%。
3.6.2 计算
       124.5U/L GGT样本的扩展不确定度:

4 GGT催化活性参考方法测量不确定度评定模型 

其中f0为GGT催化活性参考方法测量过程中影响测量结果的恒定分量的影响函数:

5 小结
       本文建立的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型从理论上与GUM和QUAM评定不确定度的方法一致。本法基于“实验设计”方法评定测量不确定度分量,采用“module”方式评定测量结果的不确定度,可操作性强。

参考文献
【1】 BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML. Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)[M]. lst edition.Switzerland:International Organization for Standardization,1995.
【2】 EURACHEM/CITAC. Quantifying uncertainty in analytical measurement(QUAM)[M].2nd edition. EURACHEM/CITAC.2000.
【3】 刘文卿.实验设计【M】. 第2版.北京:清华大学出版社,2005:1-48.

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