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CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南

来源:检验医学网    阅读:

包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在内的临床微生物的检验方法(检验程序)如何验证?很多人对此非常困惑。由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。虽然是针对认可实验室制定的指南文件,其他实验室亦可参考。
部分内容节选

    显微镜检查

4.3 显微镜检查
显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。实验室在开展各种类
型显微镜检查(如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等)前应对本实验室使用的检验程
序进行验证,并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。检查方法可包括手工染
片法和自动化染片法。所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质,并按照实验室
生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求
显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对(当多
名人员从事该项目时)。如果没有可获得的能力验证或室间质评,实验室应自行组织实验室间比对(宜与通过认可的实验室比对)。若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法,应进行两种方法的实验室内部比对。
4.3.2 比对方案
4.3.2.1 样品数量
每项检查应使用至少 5 份样品进行验证,覆盖全部样品类型,无菌样品类型包含
阴性和阳性结果。实验室应优先使用已知结果的留样样品,当不可获取时可采用模拟
样品。
4.3.2.2 检验程序
按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、
染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告
根据实验室程序文件规定进行结果报告,其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”
报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准
每项检查的比对结果符合率≥80% 。

    分离培养

4.4.1 血培养
血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物(包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等)以及仪器(自动化系统)能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
血培养性能验证常用留样验证和血培养系统平行比对两种方法。血培养系统平行比对用于评估验证系统和参比系统检出细菌能力的一致性,但需要样本量大,临床采样有难度。留样验证的优点则在于可评估其检测不常见病原菌的能力。实验室可根据医院病人数量和地区、病种特征等具体情况和两种方法的特点选择其中一种适宜的验证方法,或两种方法同时应用。
4.4.1.1 留样验证
4.4.1.1.1 验证要求 
验证应覆盖临床常见微生物,需氧成人/儿童血培养瓶验证菌株应包括需氧/兼性厌氧革兰阳性菌、需氧/兼性厌氧革兰阴性菌、苛养菌 (如:流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等)和真菌,厌氧血培养瓶验证菌株应包括兼性厌氧革兰阳性菌、兼性厌氧革兰阴性菌、专性厌氧菌,其他特殊用途血培养瓶参照厂家要求选择合适类型菌株进行验证。每种类型至少1株,总体不少于 15 株。应尽可能使用真实患者的临床分离菌株
(性能验证用临床留样菌株宜经质谱或 DNA 序列分析确认)。对于特殊、苛养菌可使用标准菌株或质控菌株。某些特殊菌株需要在培养瓶中加入无菌、未使用抗生素的厂家推荐血液标本,如不加可能不生长,如流感嗜血杆菌。
4.4.1.1.2 验证方案
模拟临床血流感染患者的细菌含量,用留样菌株进行一系列稀释,接种细菌的最
终浓度为 5-30CFU/瓶。若苛养菌需添加适量的新鲜无菌血液(成人瓶 5-10ml,儿童瓶1-3ml)后置于血培养系统上进行培养、检测。
4.4.1.1.3 可接受标准 
如果在厂家说明书规定时间内检测出所有菌株则该方法通过验证。 3 天时间应足以
检测出至少 95%的临床相关细菌, 须具备苛养菌、真菌、厌氧菌等的检出能力。 若未能检出应使用相同菌株进行重复试验来验证。若仍不能检测,实验室和/或制造商应在临床使用该系统前采取纠正措施。如果血培养仪升级,原系统和新系统的差别不大,培养瓶也没有改变,那么由供应商技术代表核查仪器性能即可,无需再次验证。功能核查将对孵育系统和光学系统以及软件是否按照制造商规定运行进行评价。
4.4.1.2 血培养检测系统比对
4.4.1.2.1 验证要求
因血培养检测系统比对要求较高,并非强制要求执行。同一厂家由同一系统控制采集
数据的多个血培养模块不需进行比对。
检测系统比对允许根据患者情况和实验室条件来评价新系统的性能,通常比对所
需临床标本数量应≥100 例。
4.4.1.2.2 验证方案 
同一病人按照同样的采血方法采集血液标本,接种验证血培养瓶和参考血培养瓶
中,分别放入各自的培养系统上进行培养、检测。
4.4.1.2.3 可接受标准
与参考方法相比,新培养系统检测符合率至少为 95%。如果未能满足性能要求,则
该实验不能通过验证或者制造商和/或使用者须采取正确的纠正措施并再次进行验证。
4.4.2  一般培养(非血液标本)
一般培养包括各类标本(痰液、尿液、粪便、分泌物、组织等)的细菌(含厌氧菌、
结核分枝杆菌)、真菌、支原体等的培养。培养程序包括标本处理、接种、培养基选择和适宜培养条件(温度、气体等)。实验室在开展各种类型标本微生物培养检验前应针对培养目的对本实验室使用的检验程序进行验证。如果没有可获得的能力验证或室间质评,实验室可采用培养基验证方法对培养程序进行验证。使用质控菌株或留样菌株模拟标本进行培养,验证该培养程序是否满足检出性能要求。
4.4.2.1 验证要求
每项检查每种样品类型至少 1 份标本。
培养基根据其用途主要分为两种:选择性培养基和非选择性培养基。选择性培养基包含能够抑制某些微生物生长的抗生素或化学试剂,非选择性培养基则不含抑制微生物生长的物质,能够促进大多数微生物的生长。无论商品化培养基还是自配培养基,都需要在使用前对培养基性能进行验证,验证菌株可选择质控菌株或临床菌株。
对于某些苛养细菌专用培养基,实验室必须确定该培养基能保证对应苛养细菌的生长。如:厌氧菌、百日咳博德特菌、弯曲菌、螺杆菌、军团菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生长条件的细菌。而对于一些非选择性培养基,如血平板和巧克力平板需保证其能支持大部分细菌的生长。
4.4.2.2 验证方案
标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株均可用做验证菌株,实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。
4.4.2.2.1 直接接种法
按照实验室细菌分离培养 SOP 直接接种菌株至培养基上,观察细菌生长情况。如果使用直接接种,应谨慎操作。接种菌量过多或者过少都将掩盖培养基的促进或抑制生长的特性。如果在使用直接接种法时出现验证不合格,则改用标准化菌悬液进行验证。
4.4.2.2.2 标准化菌悬液法
不同实验室之间可进行标准化菌悬液验证比对。较高浓度的菌悬液能够较好测试选择性培养基抑制特定微生物生长的能力。较低浓度的菌悬液则能够验证非选择性培养基充分支持细菌生长的能力。
第一步:菌悬液的准备 
(1)直接菌落法:使用培养 18 到 24 个小时的菌落,在 0.85%无菌生理盐水中制成菌悬液,使其浊度达 0.5 麦氏浊度。
(2)生长法:从 24h 培养物中接种 3 到 5 个菌落至无菌肉汤以此制备悬浮液。孵育数小时使其浊度达 0.5 麦氏浊度。
第二步:接种
(1)验证非选择性培养基
用无菌肉汤或者生理盐水将 0.5 麦氏单位菌悬液进行 1:100 稀释,每个测试平板接种 10μl(0.01ml)悬浮液,均匀涂布。如果菌落过密,则可将菌液稀释 1000 倍后再接种。
(2)验证选择性培养基
用无菌肉汤或者生理盐水将 0.5 麦氏单位菌悬液进行 1:10 稀释,每个测试平板接种 10μl(0.01ml)悬浮液。如果菌落过密,则可将菌液稀释 100 倍后再接种。
(3)验证培养管
用 10μL(0.01mL)未稀释的 0.5 麦氏浊度悬浮液进行接种。
培养温度、气体条件和培养时间执行实验室 SOP 文件规定。
4.4.2.3 可接受标准
4.4.2.3.1 在选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典
型,并且能够抑制特定微生物的生长,可判定性能符合要求,验证合格。
4.4.2.3.2 在非选择性培养基上验证菌株长势良好、 菌落大小与预期相符、菌落形态典
型,血培养基上的溶血类型符合,可判定非选择性培养基验证合格。
4.4.3 活菌计数
临床微生物实验室需对中段尿、肺泡支气管灌洗液等标本进行活菌计数。活菌计
数定量培养除验证对病原菌的分离能力外,还需对定量接种环进行验证。定量接种环
不如微量加样器准确,但仍不失为半定量培养或者稀释的一种很好的方法,在允许 20%误差存在时可以使用定量接种环。
4.4.3.1 验证要求
定量接种环使用前应进行验证(使用微量加样器只需计量检定),一次性定量接种环
每批次应抽样验证。
4.4.3.2 验证方案
可以采用钻头法和浸染法两种方法,钻头法适用于重复使用金属环,浸染法适用于
重复使用金属环和一次性接种环。
浸染法较易于实施,方法如下:
第一步:配制Evans blue染液(EBD)。用蒸馏水稀释Evans blue染液为1:500、1:1000、1:2000、1:4000。 
第二步:用1ul环取10环EBD原液至10ml蒸馏水中;10ul环取10环EBD原液至100ml蒸馏水中,或至10ml蒸馏水中后再稀释10倍。
第三步:用722分光光度计600nm波长比色,重复四次。
第四步:计算
1ul环和10ul环分别配置溶液的吸光度应与1:1000EBD稀释液相符。以1:1000稀释
液的吸光度为比对测定值,计算接种环定量配制溶液吸光度与比对测定值的偏差。
偏差=检测测定值-比对测定值/检测测定值×100%。
4.4.3.3 可接受标准
允许范围:平均偏差不超过 20%。

    微生物鉴定试验

4.5 微生物鉴定试验
4.5.1 微生物鉴定系统
包括传统生化鉴定系统、质谱鉴定系统、分子生物学鉴定系统等。本指南主要适
用于商业化配套的传统生化鉴定系统,质谱和分子鉴定系统的验证可参考执行,但还
需满足该技术的专项要求。
4.5.1.1 验证要求
按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株,试验应覆盖实验室使用的全部卡片种类和/或方法一些大型医院,其患病人群更复杂、微生物种类更多,这类医院应对更多的菌株进行评估。对于特定地区和机构, 考虑到特殊标本不易获取以及病人等因素,验证菌株的选择可适当调整。
4.5.1.2 验证方案
菌株种类的选择应参照厂商说明书,覆盖革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、厌氧菌、念珠菌、隐球菌等。包括临床留样菌株和标准/质控菌株。每种类型应至少 1株,总体不少于 20 株。按厂家说明书或实验室检测程序规定对验证菌株进行检测,一般要求鉴定至种水平。对于特殊类型的微生物(如棒状杆菌、厌氧菌,芽孢杆菌),可将鉴定到属的水平作为可以接受的性能标准。
4.5.1.3 可接受标准
标准/质控菌株符合率应为 100%,临床菌株的符合率应在 90%以上。若未能满足要求,则该检测系统不能通过验证或者制造商和/或使用者须采取措施。修正后的检测系统应再次进行验证。
4.5.2 血清学鉴定试验
血清学鉴定试验包括沙门菌/志贺菌/致病大肠杆菌/弧菌等的血清学分型。
4.5.2.1 验证要求
沙门菌至少包括伤寒沙门菌/甲型副伤寒沙门菌/乙型副伤寒沙门菌/丙型副伤寒沙门菌;志贺菌包括福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌四种;致病大肠杆菌/弧菌等根据当地卫生行政管理和实验室情况进行选择。优先选择标准菌株和质控菌株,也可使用实验室确认过的留样临床分离株。
4.5.2.2 验证方案
参照实验室操作规程进行操作。每种本地区常见血清型菌株至少 1 株。
4.5.2.3 可接受标准要求准确率 100%。

    感染免疫学定性检测

4.6 感染免疫学定性检测
包括艰难梭菌毒素检测、梅毒免疫学检测(RPR/TPPA/TRUST)、肥达外斐试验、真菌免疫学检测(G 试验/GM 试验)等。
4.6.1 验证要求
检测至少 20 份样品,通常阳性样品和阴性样品各占一半。对检测的报告范围进行验证时应包括弱阳性和强阳性样品。若弱阳性样品不好获取,可用适当的基质稀释强阳性样品获得类似的效果。
4.6.2 验证方案
对于未经修改的商业化试剂盒方法来说只需要验证符合率即可,但若该项测试为高度依赖人工操作的实验还应通过不同操作人员进行重复性/重现性的验证。
符合率:将新检测系统的实验结果与参考方法(金标准)或比对方法/其他实验室进行比较,计算待验证方法的阴阳性符合率。
重复性/重现性应经不同批次进行验证。评估重复性时,应在一个样本批内对至少两个阳性样品、两个阴性样品进行重复测定。然后在不同批次重复这一过程,必要时还要更换操作人员。
4.6.3 可接受标准
符合率:与参考方法(金标准)或比对方法/其他实验室相比其符合率应≥80%重复性/重现性:对于多人多批次检测,结果应完全一致。

    抗菌药物敏感性试验

4.7 抗菌药物敏感性试验
抗菌药物敏感性试验(药敏试验)可分为纸片法和最低抑菌浓度法(MIC 法)。
4.7.1 验证要求
药敏试验方法的评估宜既保证药敏试验的准确性,也要确保耐药菌株的检出灵敏
性。例如,革兰阳性菌药敏卡应能检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、革兰阴性菌药敏卡的检测范围应包括超广谱β-内酰胺酶、碳青霉烯类耐药的检测,细菌覆盖多重耐药肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌等。药敏卡的选择应遵循生产厂家说明书要求,不应超范围使用。
药敏试验性能验证可使用药敏质控菌株。
4.7.2 验证方案 
参考 CLSI 细菌、真菌相关药敏试验操作及判断标准,选择药敏质控标准菌株和药
物。连续检测 20-30 天,每一组药物/细菌的抑菌圈直径或最低抑菌浓度(MIC)超出参考范围的频率应不超过(≤)1/20 或 3/30;也可采用替代质控方案,即连续 5 天,每天对每一组药物/细菌重复测定 3 次,每次单独制备接种物, 15 个数据中超出参考范围(抑菌圈直径或 MIC)的结果应不超过(≤) 1 个,若失控结果为 2-3 个,则如前述,再进行 5 天,每天 3 次重复试验,30 个数据失控结果应不超过(≤)3 个。
4.7.3 可接受标准
在新的药敏试验系统应用于临床前,须满足上述质控要求,通过后在日常检测中
转为室内控制要求。应对较大和重大偏差进行分析,以确定特定细菌结果是否受影响
并要求限制该细菌和特定抗菌药物在该设备的使用。

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