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免疫学和免疫学检验:单克隆抗体的制备

来源:检验医学网    阅读:

1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体(monlclonalantibody,McAb)。迄今世界已研制成数以千计的McAb。

单克隆抗体的理化性状高度均一,生物活性单一,与抗原结合的特异性强,便于人为处理和质量控制,并且来源容易,所以一问世便受到欢迎和重视。在医学领域中,McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。为此,两位发明者于1984年获得诺贝尔医学奖。

第一节 杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠细胞作小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长(选择原理后见),小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖,即所谓永生性。在选择培养基的作用下,只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力,形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。其原理从下列几个主要步骤阐明。

(一)细胞的选择与融合

建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体,所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞,通常来源于免疫动物的碑细胞。脾是B细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖,只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤,所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前常用的B细胞瘤株有:P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein,1975),P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein,1976),X63-Ag8.563(Kearneyetal,1979),Sp2/0-Ag14(Schulmanetal,1978)等,这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。

使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤,使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为40%(W/V)。

(二)选择培养基的应用

细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬中,经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5~7天,无需特别筛选,细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

细胞DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T),所以取三者的字头称为HAT培养基。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA,而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT细胞株,所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能,可在HAT培养基中长期存活与繁殖(图11-1)。

细胞融合与HAT选择示意图

图11-1细胞融合与HAT选择示意图

(三)有限稀释与抗原特异性选择

在动物免疫中,应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇,一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答,实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程,在已经融合的细胞中,有相当比例的无关细胞的融合体,需细筛选去除。筛选过程一般分为两步进行:一是融合细胞的抗体筛选,二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释,使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间(30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞),培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞;这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化,应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株,增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。
 

 

第二节 制备单克隆抗体的基本技术

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作,整个技术流程如图11-2。

(一)抗原提纯与动物免疫

对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。

免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。

(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。

杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程

图11-2杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程

在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。

(三)细胞融合

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。

(四)有限稀释法

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔),按Poisson法计算,应有36%的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0%~20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

(五)单克隆抗体的制备和冻存

筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为5×105/鼠,可根据腹水生长情况适当增减。

选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在-70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50%~95%之间。如果低于50%,则说明冻存复苏过程有问题。

(六)单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达90%以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合,同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时,1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
 

 

第三节 单克隆抗体在医学中的应用

单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值,是亲和层析中重要的配体,是免疫组化中主要的抗体,是免疫检验中的新型试剂,是生物治疗的导向武器。

作为医学检验试剂,单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强,可将抗原抗体反应的特异性大大提高,减少了可能的交叉反应,使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制,利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成,其主要用途如下:

1.诊断各类病原体这是单克隆抗体应用最多的领域,已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

2.肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体,但对肿瘤相关抗原(例如甲胎蛋白和癌胚抗原)的单克隆抗体早已用于临床检验。

近年来,有人利用单克隆抗体进行肿瘤分型,对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本,可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体主要用于体内诊断,结合X线断层扫描技术,可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。

3.检测淋巴细胞的表面标志用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志,有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化,对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容,而应用单克隆抗体对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。

4.机体微量成分的测定应用单克隆抗体和免疫学技术,可对机体的多种微量成分进行测定,如诸多酶类、激素、维生素、药物等;对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。

上述应用的单克隆抗体属于鼠源性,作为体外诊断试剂是满意的。鼠源单克隆抗体如作为生物制剂应用于人体,则因是异性蛋白可引起过敏反应甚至危及生命。从临床治疗及预防疾病的要求,希望制备出人源性单克隆抗体。目前虽然已有文献报道,通过人-鼠细胞杂交及人-人细胞杂交进行了一些探索,但对这些细胞株培养很不稳定,融合细胞中人的染色体往往呈选择性丢失,以致细胞株难以维持培养。因此制备人源单克隆抗体是目前急待解决的问题。

第二节 制备单克隆抗体的基本技术

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作,整个技术流程如图11-2。

(一)抗原提纯与动物免疫

对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。

免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。

(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。

杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程

图11-2杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程

在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。

(三)细胞融合

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。

(四)有限稀释法

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔),按Poisson法计算,应有36%的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0%~20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

(五)单克隆抗体的制备和冻存

筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为5×105/鼠,可根据腹水生长情况适当增减。

选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在-70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50%~95%之间。如果低于50%,则说明冻存复苏过程有问题。

(六)单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达90%以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合,同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时,1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

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