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PCR- 核酸飞行时间质谱系统检测新冠病毒方法的建立及应用研究

来源:检验医学网    阅读:

本期介绍安徽省疾控中心文章——PCR- 核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究。
 
杂志影响因子:0.719
PCR- 核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究
作者:王俊,张栋,陈晴晴,俞俊岭,杨奕,乔亮,孙永
 
背景及研究目的
 
新型冠状病毒肺炎在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异性是影响实验结果的关键因素,现荧光核酸检测方法是新冠病例确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。
 
应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,在Clin-ToF Ⅱ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。
 
方法
 
本研究收集上海市临床检验中心室间质评数据阳性40份、阴性7份,国家卫健委室间质评数据阳性41份、阴性33份。本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共 186 份样本作为建立PCR-核酸飞行时间质谱系统及判读标准的数据,并于2020年1-2月收集的安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份(咽拭子样本55份、痰液样本25份)及健康人群样本20份(均为咽拭子样本)作为评估PCR-核酸飞行时间质谱系统效果的数据。建立PCR-核酸飞行时间质谱系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶(SAP)消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模板量。根据186份样本检测质谱峰的信噪比(SNP)确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2病例样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。
 
结果
 
建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2 核酸的开放读码框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因进行有效扩增检测。通过对PCR-TOF MS模板条件的优化,模版量6 µl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图(图1)。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR的75.00%。同时结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25%的可疑结果,而PCR-TOF MS 则无可疑结果(表1)。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为 100% 和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%(表2)。阴性样本两种方法均检测为阴性。
 

结论
 
通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-COV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性。研究同时证实了痰液样本优于咽拭子样本,PCR-核酸飞行时间质谱方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。
 
评论
 
本研究应用MALDI-TOF MS原理,在Clin-ToF-Ⅱ飞行时间质谱系统上,建立了PCR-核酸飞行时间质谱检测SARS-CoV-2的方法。并通过对 COVID-19 疑似患者的核酸样本进行检测,评价检测性能及实际应用价值。
 
PCR-核酸飞行时间质谱方法可应用于SARS-CoV-2核酸检测,有较好的特异性和敏感性,样本检出率高于实时荧光定量 PCR 方法,尤其对实时荧光定量 PCR 报告疑似样本有较高的阳性率,可明确判断结果,降低漏诊率。在现有SARS-CoV-2临床诊断及密切接触者确诊环节中,存在大量可疑样本需要实验室检测的多次验证,该方法的建立大大提高了检测效率,减少了实验室重复验证的过程,更早地提供了实验证据,也为疫情研判缩短了时间。
 
样本的病毒含量、标本类型、试剂盒质量、采样方法,样本运输等问题均可能导致核酸检测结果不准确,且容易出现“假阴性”现象,本研究通过对咽拭子和痰液标本的检测结果分析,发现无论是实时荧光定量PCR法还是PCR-核酸飞行时间质谱法,疑似COVID-19病例的痰液样本阳性检出率明显高于咽拭子样本,且假阴性率低于咽拭子样本。这与SARS-CoV-2 易于在下呼吸道繁殖生长相吻合,提示样本采集应尽量采集下呼吸道标本。
 
飞行时间质谱技术在应用方面不仅可以进行蛋白质多肽检测、微生物鉴定、糖基化检测,同时还可以进行基因的SNP、突变、甲基化及拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析。在临床检测领域,其基因检测的功能还未得到充分的开发,但鉴于其灵敏度高、特异性强,检测成本低、高通量和高准确性等特点,在核酸检测方面具有广阔的应用前景。
 
 
 
毅新质谱成立于2003年,是国内首家专注于临床质谱系统研发、生产的企业。2006年,公司创始人兼董事长马庆伟博士发表了一篇题为《MALDI-TOF MS引领分子诊断新时代》的论文,引领临床质谱产业的发展。2014年6月,公司自主生产研发的Clin-TOF飞行时间质谱系统通过国家食品药品监督管理总局(CFDA)医疗器械认证。作为国内最先取得CFDA注册证书的临床飞行时间质谱企业,毅新在全球首创并实现了单机多组学检测,一台机器可满足微生物鉴定及核酸检测等领域的临床应用,技术已经完全达到国际领先水平。2019年初,公司自主研发的Clin-ICP-QMS-I也通过了CFDA医疗器械认证。截止目前,软银赛富、北京崇德弘信、汉富资本等著名投资公司已对毅新累计投资过亿元。

 
截至目前,毅新申请专利 215项,已获授权 55 项;多项已申请国际 PCT 专利;获得软件著作权 13 项,与中国人民解放军总医院、上海瑞金医院、北京大学口腔医院、广州中山肿瘤医院等单位合作发表 SCI 论文超过 30 篇,先后承担 “2012年科技部国家重大科学仪器设备开发专项-生物安全专用基质辅助激光解吸仪”(2018年以91.7分优异成绩通过验收)、“2014年科技部国家高技术研究发展计划(863计划)-激光解吸基质辅助离子源-蛋白测序仪器”、“2017年度精准医学撰写-临床定量蛋白质组的质谱仪及配套试剂的研发”、“2018年北京市科委-基于飞行时间质谱的微生物鉴定等临床检测方法的应用推广”等课题。获得了2017年北京市科学技术奖、浙江省科学技术奖,2018年中国分析测试协会科学技术奖(CAIA奖)一等奖等殊荣。

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