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电泳技术的现状和发展

来源:检验医学网    阅读:

  沈    霞

   早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学物理化学系Svedberg教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳(electrophoresis)。于1937年,收Arne Tiselius教授---诺贝尔奖金获得者,利用些电泳现象,发明了最早期的界面电泳(moving boundary),用于蛋白质分离的研究,开创了电沪泳技术的新纪元。此后,各种电泳技术及仪器相继问世,先进的电泳仪和电泳技术的不断发展,使它在生物化学实验技术中占重要地位,按电泳的原理有三种形式的电泳分离系统:原则上按电泳的原理来分,即移动界面电泳(moving boundary ek|lectrophoresis)、区带电泳(zone electrophoresis)和稳态电泳(steady state electrophoresis)或称置换(排代)电泳(displacement electophoresis)。在自由移动界面电泳,是带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定,该方法已成为历史。代之以采用支持介质的区带电泳。

   区带电泳因所用支持体的种类、粒度大小和电泳方式等不同,其临床应用的价值也各有差异。固体支持介质可分为两类:一类是滤纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等;另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。由于它们具微细的多孔网状结构,故除能产生电泳作用外,还有分子筛效应,小分子会比大分子跑得快而使分辨率提高。它的最大优点是几乎不吸附蛋白质,因此电泳无拖尾的现象。低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳,蛋白质在电场中可自由穿透,阴力小,分离清晰,透明度高,能透过200~7000nm波长的着色区带的检测敏感性,为此第一类支持介质现已被第二类支持介质所替代。

    稳太电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态,如等电聚焦和等速电泳。

    区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术,有重要临床意义,尤其是其他新技术,更扩大了其应用范围,提高了检测技术,现对该技术的现状与发展作一评述。

一、 正确解释电泳结果,有助于临床疾病判断的参考

    新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌,一般常见的是白蛋白降低、某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。如急性炎症时,可见a1,a2区百分率升高;肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降,a2球蛋白升高,β球蛋白也升高;缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高,而慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显著降低,r球蛋白升高2-3倍,示免疫球蛋白多克隆增高,甚至可见β-r融合的桥连现象,还可在r区呈现细而密的寡克隆区带;对单一克隆浆细胞异常增殖所产生的无抗体活性均一的免疫球蛋白称M蛋白(monoclonal protein)的检测,血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。 可在电泳区带的a2-r区呈现致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生区带,称其为m蛋白区带,扫描后形成高而狭窄的单株峰 ,若些峰在r区其峰高与峰底宽之比>2:1,而由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色浅。由M蛋白所导致的一组疾病如:多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等,目前这类疾病已不属罕见。血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断,疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。


二、 电泳技术与免疫技术相结合,大大扩大了其临床应用的范围
    让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反应速度。免疫
电泳技术的种子类很多,如:对流免疫电泳(CIEP)、火箭免疫电泳(RIE)、电免疫扩散(EID)。在种免疫电泳 方法牟基础上,又不断地派生出一些新的技术,如:免疫电泳(IEP)技术,1969年Alper与Johnson推荐免疫固定电泳(IFE)是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作,是免疫沉淀反应的一种混合技术,检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其他体液。1976年血清免疫固定电泳(IF)技术再次被推荐,用于M蛋白的分型。血清蛋白质在琼脂糖凝介质上经电泳分离后,应用固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清,加于凝胶表面的泳道上,经孵育让固定剂和抗血清的在凝胶内渗透并扩散后,若有对应的原存在,则在适当位置形成抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色,根据电泳移动距离分离出单克隆组分,可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。该技术的最大优势是敏感性达50-150mg/dl,操作周期短,仅需数小时,分辨率高,结果易于分析。现最常用于M蛋白的分型与鉴定,已列入临床实验室的常规检测工作。


三、 电泳技术进行同工酶谱分析,提高诊断率

    1、血清乳酸脱氢酶同工酶(iso-LDH):测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法,但迄今用得取多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带,急性必肌梗塞发病后平均6h LDH1即开始升高,LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平,肝癌时可见LDH5明显升高,各区带含量的确定,将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量,其精确度明显高于用肉眼判断。

    2、血清肌酸激酶同工酶(ISO-CK);测定CK和CH-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的道选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK=MB,其原理为抗M亚单位的酶活性,因为正常血清中几乎无CK=BB,故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速,缺点是特异性差,如患者血清中存在CK-BB或者异常CK时,都将出现假性增高。不少作者报道异常CD-同工酶,一条称巨CK(Maxro-CK),它是CK-BB与免疫球蛋白的复合物,有IgG亦有IgA,在正常血清中Marco-CK仅占0.8%-1.6%.另一条称线粒体CK(CK-MT),CK-MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面,可能是线粒体膜的碎片,在正常血清中CK-MT是不出现的,在心梗时亦不出现,只有当组织极度损伤,由于线粒体和细胞壁极度破坏,方可在血清中检出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗体所抑制,故当它们出现时,会导致CK-MB高于CK总活力的假性升高。使用电泳方法分离CK-MB,是根据CK-同工酶分子结构不同,在电泳缓冲液中,所带电荷各异,可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离,其分别为CK-MM,CK-MB和CK-BB。电泳特点是当出现异常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等,从电泳图谱上很容易发现,由扫描仪对各条酶进行扫描,报告各条区带所占百分比,结合总酶活力,求得区带的酶省略定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间,而CK-MT位置靠近阴极端,在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊,也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此,CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术,具有十分重要的临床意义。

    3、CK亚型同工酶:此外,CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳,由于操作比一般电泳麻烦,故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪,有试剂盒提供,可作CK亚型分析,参考值:CK-MM1(57.7±4.7)%;CK-MM2为(26.5±5.3);CK-MM3为(15.8±2.5)%;CK-MM3/CK-MM1比值为0.28±0.05(范围0.15-0.39),阳性决定性水平>0.5 。AMI第一天血中以MM3为主,但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB,CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微,一般比值近似是而非,在急性心肌梗塞后4-6h CKMB2亚型即在血循环中可被检测到,故MB2/MB1的比例明显升高,并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比便也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。


四、 结合酶免疫标记抗体技术,检测脑脊液内寡克隆区带

    曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定,方法繁复,耗时,
现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质,并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”(OCB),经此酶免疫标记放大技术和显色步骤,蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测,可使检测灵敏度提高了100倍,这样脑脊液无须浓缩,避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB,而其相应标本中未能检出区带,则为阳性,真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白,具有重要临床意义。它是一种定性检测,在多发性硬化症时,OCB是一个十分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析,以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用于诊断的鉴别诊断中枢神经系统疾患如:多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅素等。


五、 利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白(a),用于心、脑知管独立的危险因子的检测
 
    该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳,再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同,不仅可区分a、前β和β区带,又因介质中含有抗脂蛋白(a)[LP(a)]抗体及阳离子存在,抗LP(a)与患者血清中LP(a)结合形成复合物,阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其他脂蛋白分离开来,使分辨十分清晰的LP(a)条带呈现在前β与γ区域之间,将阳性条带扫描后,可获得区带的面积及其百分含量,该方法使电泳技术趋于完美,大大减少了手工操作的弊端,既可予以半定量,又能将胶片保存,便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子----LP(a)检测的敏感性和特异性。


六、 按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳,区分尿蛋白类型

    尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型,可在无操作的情况下,
协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离,该法具有局限性,耗时,操作繁琐,标本要求高,尿液需预浓缩,不适于临床实验室广泛开展。SDS=AGE电泳不需预浓缩,尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区,带主要反应肾小球病变;呈现出低分子量蛋白区带,可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿;混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带,示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描,求出百分比,以显示肾小球或肾小管损伤程度,其电泳图谱及扫描图形可作国资料永载,利于分析比较。该技术的最大进步是尿液不需预浓缩,操作简便,结果清晰,仅需三小时即可完成试验,还备有完整的定性标准,易于量化,便于分析,对肾脏疾的诊断,鉴别诊断,指导治疗和判断愈合颇有价值。

   近期发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳,又称毛细管带电泳。它是在毛
细管中装入缓冲液,在其一端注入样品,在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离,他离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。毛细管电泳在检验医学中的应用也十分广泛,从所检测样品的来源看可分为尿样、血浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织,以及实验动物活体等。从分离对象看包括蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、离子、药物及其代谢产物等。根据用途可分为临床疾病诊断、临床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。由于它具有无法比拟的高效和快速性,因而受到越来越多科学家们的重视。

    中国的电泳技术起步不算太晚,但由于种种原因,大多数实验室仍采用较落后的电
泳设备。随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进,电泳技术也在不断发展和更新,其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值,相信随着该技术的不断发展必将越来越受到同道们的青睐。

 

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